12.11.2008

Saccharomyces cerevisiae en la fabricación del licor cocuy.
¿Qué es el licor de “cocuy”?
El licor "cocuy" es una bebida artesanal, producida por las comunidades rurales en el occidente de Venezuela mediante un proceso de fermentación y destilación del mosto extraído del Agave cocui. Este estudio fue enmarcado en el "Programa Agave" con el propósito de contribuir a rescatar esta actividad productiva tradicional. En vista de la falta de información en relación al proceso autóctono se hicieron estudios de las levaduras fermentadoras, la optimización de la producción de etanol y la utilización del residuo de la destilación (vinaza) como medio de cultivo. Los aislados con mayor capacidad fermentativa fueron seleccionados e identificados mediante parámetros morfológicos y metabólicos. Se compararon los niveles de consumo de azúcar de las levaduras con mayor capacidad fermentativa. Se estudió el efecto de la adición del azúcar blanca comercial y/o del fosfato de amonio y en la producción de alcohol en el proceso artesanal. Las concentraciones de azúcares en el mosto se evaluaron por refractometría, y el contenido de alcohol del licor por hidrometría. La utilización de la vinaza para la producción de biomasa como un componente del medio de cultivo fue comparada con un medio sintético mediante medidas del peso seco de la biomasa. Se confirma el papel de Saccharomyces cerevisiae en el proceso fermentativo espontáneo. Los resultados in situ evidenciaron un efecto favorable de la elevación del contenido de azúcar (11 a 18°Brix) y de la adición de fosfato de amonio dibásico (0,2 g/l). En estas condiciones, el tiempo de fermentación del mosto se acortó y la producción de licor aumentó hasta un 92%. Se demostró la posibilidad de utilizar la vinaza como un componente para un medio de cultivo de esta levadura, para iniciar la fermentación y para la producción de biomasa como una fuente de nutrientes de alto valor nutritivo para aves de corral o caprinos. Se recomienda apoyar los esfuerzos para desarrollar de esta importante fuente de ingresos para los campesinos que habitan las zonas semi-áridas de los estados Falcón y Lara.
HISTORIA DE SU OBTENCIÓN
Los indios Jiharas y Caquetíos, habitantes de Paraguaná, Coro y el Occidente falconiano, preparaban una bebida alcohólica con el zumo de la planta llamada "cocuy" (Agave cocui). Esta bebida, autóctona de los estados Lara y Falcón, es embotellada sin maduración, comercializada en Venezuela y exportada a Curaçao. En l976, la Ley de Alcoholes y Bebidas Espirituosas estableció normativas para la maduración del producto, siendo desde entonces una actividad clandestina, cada vez más precaria, en las zonas rurales semi-áridas del Occidente del país. Con el propósito de contribuir al rescate de esa actividad productiva, se implementó el "Programa Agave", incluyendo esta investigación en su primera fase (1998-2001) (1,2).
El mosto o "guarapo", obtenido a partir del prensado de los cormos de las plantas, una vez sometidas a hidrólisis por calor, es mantenido en barriles durante 3 a 5 días. El proceso de fermentación espontáneo depende de la cantidad de levaduras y de la concentración de azúcar del jugo. La destilación, introducida por los colonizadores españoles, se lleva cabo en un alambique rústico eficiente, obteniéndose una bebida con un 45 a 50% de etanol, muy similar a la bebida conocida como "tequila", originaria de México. En vista de la falta de información relacionada con el proceso artesanal autóctono, se abordó el estudio de las levaduras responsables de la fermentación, con la colaboración de los productores de Pecaya, en el estado Falcón.
Nuestros resultados permitieron confirmar el papel de Saccharomyces cerevisiae en la producción del licor cocuy, evaluar el aumento de la productividad mediante la adición de azúcar blanca de caña y fosfato de amonio dibásico, así como establecer la posibilidad de la utilización del residuo del destilado, llamado "vinaza", para el cultivo de esta levadura como iniciador de la fermentación y fuente de alimento.
MATERIALES Y METODOS
Toma de muestras: Seis alícuotas de 1 litro del mosto de Agave cocui fueron recogidas en 3 oportunidades durante el proceso artesanal de dos productores, directamente de las pipas, las cuales pueden contener de 200 a 250 litros (al inicio del proceso fermentativo y antes del destilado), en la localidad de Pecaya, situada en la zona semi-árida al sur del estado Falcón, en Venezuela, donde se fabrica tradicionalmente el licor cocuy, obtenido por destilación en alambiques caseros del mosto fermentado.
Aislamiento de las levaduras fermentadoras e identificación: Las muestras fueron sembradas por agotamiento por estría en placas de Petri, en medio Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) e incubadas a temperatura ambiente del laboratorio durante una semana. La identificación de las cepas seleccionadas se hizo mediante estudios morfológicos en microscopía de luz, tamaño, temperatura óptima de crecimiento, formación de ascosporas en medio Gorodkowa, coloración con verde malaquita y safranina y prueba de asimilación de azúcares (auxonograma) en medio Yeast Nitrogen Base DIFCO 0,067 g, agar 20 g/l (3, 4).
Pruebas de fermentación: Los aislados fueron cultivados en medio para la fermentación (caldo cerebro-corazón de Merck 25g, extracto de levaduras 5g, glucosa 10 g, azul de bromotimol 0,05 g en 1 litro, Ph 7) por el método de los tubos invertidos de Durham, incubados por 3 días a 30°C. Se seleccionaron los aislados que presentaron un 100% en la prueba de producción de CO2, y se aislaron por repiques en cuñas de SDA. Los cultivos se incubaron a 37°C por 7 días (3,5).
Ensayos de consumo de azúcar: Los aislados fueron crecidos en tubos con SDA durante 8 días. Tres asas de la colonia fueron repicados en 50 ml de medio líquido SD por 48 horas en agitación a 150 rpm, incubando a 35°C, para obtener la suspensión celular para la inoculación. Se realizaron las pruebas de la capacidad de fermentación y se comparó la eficiencia en el consumo de azúcares en las cepas seleccionadas (medio: solución de melaza a 17/18 °Brix, pH 5, en fiola de 1 l, incubando a 35°C por 7 días). El contenido de azúcares se evaluó en °Brix por refractometría, y se aplicó la interconversión de °Brix a porcentaje de azúcar peso/volumen (5,6).
Efecto de la adición de azúcar y fosfato diamónico en la producción de alcohol: Se comparó la productividad al inicio y al final del proceso artesanal en 4 condiciones experimentales: 2 con el fin de conocer el efecto de la adición de azúcar de caña blanca comercial por los productores (llevando la concentración del mosto puro de 11 a 18 °Brix), y 2 añadiendo 0,2g/l de fosfato diamónico. Se determinó % v/v de alcohol en el destilado por hidrometría con un alcoholímetro; se utilizó el análisis de kjeldahl para detección del nitrógeno en el destilado (6).
Producción de biomasa: Se comparó la producción de biomasa para la cepa S. cerevisiae UNEFM 16, medida por peso seco, entre un medio sintético y 2 medios complejos con melaza y/o vinaza. Medio sintético: D-dextrosa: 10 g/l; sulfato de amonio: 4g/l; sulfato de magnesio 2 g/l; extracto de levadura 6 g/l ; fosfato monopotásico 8 g/l. Medio con melaza: Sales de amonio 2 g/l; melaza 2 °Brix. Medio con vinaza y melaza: Vinaza 2 °Brix; melaza 2 °Brix; fosfato de amonio 4 g/l. Los cultivos se hicieron en 100 ml del medio sembrado post esterilización con 10 ml de una suspensión celular crecida en medio sintético en las mismas condiciones que los ensayos. Los cultivos fueron incubados por 2 días a 30°C a 100 rpm. en matraces de 250ml.
RESULTADOS
De los 188 aislados obtenidos de las diferentes muestras de mosto, un 95% presentaron capacidad para fermentar; 46 (24 %) presentaron la máxima eficiencia en las condiciones experimentales del laboratorio, siendo identificadas como S. cerevisiae 30 de ellas (
tabla 1; figuras 1 y 2).
El rango en el consumo de azúcar se estimó entre 41 y 78% para 16 cepas de S. cerevisiae, seleccionadas por su alto poder fermentativo (tabla 2).
Los resultados in situ permitieron confirmar un efecto favorable del azúcar y del fosfato de amonio en la productividad de proceso fermentativo artesanal, acortando el tiempo de fermentación y aumentando el volumen de licor obtenido de sólo l3 litros en el mosto puro hasta 25 litros. El tenor en alcohol se elevó a 49% con la adición de fosfato independientemente del contenido inicial de azúcar en el mosto. No se detectó la presencia de nitrógeno en el destilado. La temperatura en el mosto durante el proceso espontáneo se mantuvo a 29°C (tabla 3).
La biomasa alcanzada con un medio utilizando residuo de la industria azucarera (melaza) y de la destilación del mosto (vinaza) fue comparable al que se obtuvo con el medio sintético (
tabla 4).
DISCUSIÓN
El proceso de fermentación alcohólica en el proceso espontáneo artesanal dependería fundamentalmente de las levaduras Saccharomyces cerevisiae, especie responsable de la producción de bebidas alcohólicas como el tequila y el vino. Se trata de una población mixta, principalmente levaduras del género Saccharomyces con diferentes capacidades fermentativas y de asimilación de azúcares. No puede, sin embargo, descartarse el papel de otras especies de levadura en la población salvaje estudiada, ni que se pudiera establecer una sucesión durante el proceso. El campo por explorar es muy amplio, ya que se presupone que las levaduras juegan un papel importante en las características singulares que diferencian el producto según su origen, ya oficialmente reconocida la denominación para la producción licor cocuy en Pecaya.
La utilización de azúcar de caña refinada es una práctica establecida, habitual en la elaboración artesanal por los productores, con lo cual persiguen aumentar su producción, y, de hecho, se ha establecido la existencia de dos tipos de licor cocuy en Pecaya: tipo I (producido con mosto puro) y tipo II (mosto con azúcar blanca refinada) (2). Nuestros resultados demuestran que con este práctica se asegura un aumento de un 53% en el volumen de licor producido, si se compara con los l3 litros obtenidos con mosto puro.
Se ha señalado que las sales son necesarias para el desarrollo de las levaduras, y suelen encontrarse en pocas cantidades en los mostos, por lo cual se recomienda la adición de estos compuestos. El fosfato amónico es un material enológico oficialmente permitido por la Organization International du Vin, con un máximo permitido de 96 g por 100 litros (3,7,6). En nuestro estudio, la adición de 20 gramos por 100 litros de fosfato de amonio dibásico resultó en un acortamiento del tiempo de la fermentación tumultuosa, con intenso desprendimiento de gas carbónico. En los dos experimentos en los cuales esa sal fue añadida, se evidenció una concentración de un 49% de alcohol en el licor, independientemente de la concentración inicial de azúcar en el mosto. El volumen de destilado obtenido con el mosto con azúcar se incrementó un 92%.
Se pudo demostrar que se obtiene un substrato adecuado utilizando una mezcla de vinaza de caña de azúcar y la de ágave para el crecimiento de una cepa de S. cerevisiae, la cual presentó alto poder fermentativo y capacidad máxima para el consumo de azúcar. Se plantea la posibilidad la utilización de levaduras agregadas como "pie de cuba" como iniciador del proceso de transformación del azúcar en etanol en el proceso fermentativo, práctica utilizada en la producción vinícola (3).
Es importante considerar que en el momento en el cual se logre legalizar en Venezuela la producción de este licor, esta actividad podría suponer un problema, por la acumulación en el ambiente del residuo del proceso de destilación, la vinaza. Se ha comprobado que el pH bajo de la vinaza de ágave y la alta demanda de oxígeno de estos desechos no permitirían la disposición final en los suelos ni en los cuerpos de agua. Un proceso de separación de la biomasa, previo a la destilación de las levaduras crecidas en el mosto, permitiría disminuir el volumen del residuo. Este procedimiento se utiliza en la industria cervecera (3).
Se ha demostrado que la vinaza contiene algunos de los nutrientes necesarios para al desarrollo de las levaduras: hierro, sodio, potasio, calcio y otros elementos. La producción de biomasa con un medio de cultivo económico permitiría plantearse su cultivo. Estas levaduras representarían un componente importante para enriquecer la dieta de los animales domésticos criados por esas comunidades, como las aves y los caprinos.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Los resultados in situ evidenciaron la posibilidad de una optimización de la producción del licor mediante el uso del fosfato de amonio. Este compuesto mejora el desarrollo de las levaduras sin afectar la calidad del destilado. Se demostró la posibilidad de utilizar la vinaza como un componente para un medio de cultivo de esta levadura, para iniciar la fermentación y para la producción de biomasa, como una fuente de nutrientes de alto valor nutritivo para las aves de corral y los caprinos.
Nuestro estudio representa un primer esfuerzo para lograr una mejor comprensión de los factores microbiológicos que inciden en la calidad y la productividad del proceso de fermentación del licor cocuy, cuya composición es equivalente a la de algunos de los mejores los licores importados. Se recomienda favorecer el incremento en la producción artesanal, con el fin de contribuir a mejorar el nivel económico de las comunidades dedicadas a esa producción tradicional, y seguir las investigaciones que pudieran llevar a un desarrollo racional de esta fuente de ingreso, importante para los campesinos de los estados Falcón y Lara.
© 2008 Sociedad Venezolana de Microbiología.Sociedad Venezolana de Microbiología Apartado 76635, El Marqués, Caracas - Venezuela
Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda, Coro, estado Falcón, Venezuela.