12.12.2008

Las levaduras y el vino

El factor clave en la elaboración de los vinos.
Una levadura conocida como Saccharomyces cerevisiae es la responsable de la transformación del azúcar en alcohol, el fenómeno más trascendental en la producción de vinos. Esta levadura se encuentra en forma salvaje en la naturaleza y, generalmente, sobre el hollejo de la uva en unas especies de oasis que se llaman estomates y que están llenos de pequeñísimas gotitas de jugo de uva.
En ese medio con demasiado oxígeno esta levadura no puede desarrollarse ni hacer su trabajo. Es en el mosto en donde ella puede comenzar a transformar el azúcar en alcohol, pero aún necesita de ciertas condiciones ambientales:
1.- Temperatura: una levadura puede resistir temperaturas muy bajas. Sólo permanece estable, dormida. El calor excesivo, sin embargo, las mata. Un mosto que supera los 35 grados es un ambiente aniquilador de Saccharomyces cerevisiae. Si la temperatura comienza a aumentar, la actividad de las levaduras se vuelve más y más lenta y lo que se debe hacer es tratar de bajar lentamente porque cerevisiae no sólo odia el calor sino aborrece los cambios bruscos de temperatura. A unos 18 grados esta levadura puede hacer muy bien su trabajo.
2.- Oxígeno: tal como los seres humanos, Saccharomyces cerevisiae necesita oxígeno para poder vivir y multiplicarse, pero a diferencia de nosotros, ella puede estar sin él por un tiempo razonable (puede, en el fondo, trabajar en medios anaeróbicos). Una aireación al comienzo de la fermentación en blanco asegura una buena cantidad de levaduras que se multiplicarán y harán bien su trabajo cuando el aire falte. Esporádicas aireaciones en los tintos más la suma de levaduras externas, si es necesario, tendrán el mismo resultado.
3.- Alcohol: Saccharomyces cerevisiae puede trabajar bien en medios alcohólicos como lo son los mostos transformándose en vino, aunque no resiste extremos. Más allá de los 14 grados de alcohol, su trabajo se hace muy lento.
4.- El anhídrido sulfuroso: esta sustancia es importantísima para hacer un buen vino. Algunas de sus propiedades son un alto poder antiséptico, antioxidante y macerativo. A dosis controladas, Saccharomyces cerevisiae no tiene problemas. Las que sí tienen problemas son las bacterias que se mueren a su alrededor.

Fermentación de bebidas alcohólicas

El proceso de fermentación es producido por acción de las enzimas cambios químicos en las sustancias orgánica.
Este proceso es el que se utiliza principalmente para la elaboración de los distintos tipos de cervezas y para el proceso de elaboración de los distintos vinos

en el caso de las cervezas, el ciclo de fermentación depende del lugar donde esta se produzca, variando para los casos del tipo fabricado en Alemania, Belgica, Inglaterra, Estados Unidos, Brasil o el pais de origen que fuera.
En estos casos se divide comunmente el proceso en tres etapas. La primera de molienda, la segunda de hervor y la tercera de fermentación. Aunque al proceso completo se le conozca como fermentación, esto se debe a las diferencias entre las distintas hablas y lenguas. En inglés este proceso es mejor diferenciado para cervezas como Brew y para vinos como fermentation que es como es reconocido en lengua hispana.

El tipo de fermentación alcohólica de la cerveza es en donde la acción de la cimasa segregada por la levadura convierte los azúcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de carbono.
En detalle, la diastasa, la cimasa, la invertasa y el almidón se descomponen en azúcares complejos, luego en azúcares simples y finalmente en alcohol.

Generalmente, la fermentación produce la descomposición de sustancias orgánicas complejas en otras simples, gracias a una acción catalizada.

En el caso de los vinos, la química de la fermentación es la derivación del dióxido de carbono del aire que penetra las hojas del viñedo y luego es convertido en almidones y sus derivados. Durante la obsorción en la uva, estos cuerpos son convertidos en glucosas y fructosas (azucares). Durante el proceso de fermentación, los azucares se transforman en alcohol etílico y dioxido de carbono de acuerdo a la fórmula C6H12O6 -> 2C2H5OH + 2CO2.

En adición a las infecciones inducidas por acetobacterias y levaduras, a las cuales se les elimina la acción evitando la presencia de aire en toneles y/o depósitos, y que pueden atacar el vino transformandolo en vinagre o producir enfermedades a los consumidores, es necesario que se acentún los cuidados que eviten este riesgo a través de limpieza en los procesos, pasteurizados de la producción y microfiltraciones, para no requerir soluciones cuando el problema se ha establecido en la bebida.

LEVADURAS...¿QUE SON?

¿QUÉ SON LAS LEVADURAS?
Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares, la mayoría se multiplican por gemación y algunas por escisión. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies. Históricamente, los estudios sobre microbiología enológica se han centrado en las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, que son las responsables de la fermentación alcohólica. Anteriormente se creía que sólo ellas participaban en el proceso de producción de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras no-Saccharomyces, especialmente durante la fase inicial de la fermentación, pueden influir en las propiedades organolépticas de las bebidas alcohólicas. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de éstas en la fermentación alcohólica, pero eran consideradas como compuestos químicos complejos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wöhler. Luis Pasteur, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en condiciones anaerobias; durante la cual el azúcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2
Las levaduras son los agentes de la fermentación y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hábitat encontrándose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribución se produce al azar. Existe un gran número de especies que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproducción y por la forma en la que transforman el azúcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios géneros, cada uno dividido en especies. Las especies más extendidas son Saccharomyces ellipsoideus, Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum, las cuales representan por sí solas el 90% de las levaduras utilizadas para la fermentación del vino. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo que se refiere a nutrición y al medio en que viven. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentación apropiada rica en azúcares, elementos minerales y sustancias nitrogenadas, tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentación sea tan rápido, pero así como se multiplican, pueden morir por la falta o el exceso de las variables mencionadas

Características generales
Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfológicos, aunque para algunos microbiólogos, sus propiedades fisiológicas tienen mayor importancia. La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos, la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y otras especies lo hacen por fisión múltiple. Las levaduras que pueden reproducirse sexualmente se conocen como “verdaderas”, este proceso implica la formación de ascosporas, sirviendo la propia levadura como asca, de aquí que ellas se clasifican como Ascomicetos; por el contrario las “falsas” que no producen ascosporas, pertenecen a los hongos imperfectos.

Características morfológicas
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Además, los criterios morfológicos se basan en el modo de reproducción vegetativa de la morfología celular, de la formación de pseudomicelio y de micelio. La forma de la levadura puede ser desde esférica a ovoide, en forma de limón, piriforme, cilíndrica, triangular, e incluso alargada formando un verdadero micelio o un falso micelio. También se diferencian en cuanto a su tamaño, miden de 1-10 um ancho por 2-3 um de longitud. Son partes observables de su estructura, la pared celular, el citoplasma, las vacuolas, los glóbulos de grasa, y los gránulos, los cuales pueden ser metacromáticos, de albúmina o de almidón. Para poder observar el núcleo es preciso utilizar tinciones especiales. La estructura celular es de tipo eucariótico, pero sin sistema fotosintético. La pared rígida, se caracteriza por la presencia, en su composición, de dos polisacáridos: manano y glucano. Algunas levaduras producen una cápsula constituida por fosfomanos. El núcleo está rodeado de una membrana que persiste durante la división celular. El número de cromosomas es variable de unas a otras. Las levaduras en ningún caso son móviles.

Reproducción
La mayoría de las levaduras se reproducen por gemación multicelular o por gemación polar, que es el mecanismo en el cual una porción del protoplasma sobresale de la pared de la célula y forma una protuberancia, la cual aumenta de tamaño y se desprende como una nueva célula de levadura. En las levaduras que forman película, la yema crece a partir de una prolongación tubuliforme de la célula madre. El material nuclear replicado se reparte entre la célula madre y la célula hija (Frazier y Weathoff, 1998).
La reproducción sexual de las levaduras verdaderas (Ascomycotina) da lugar a la producción de ascosporas, desempeñando la función de asca, la propia célula de la levadura. En la mayoría de las especies de levaduras verdaderas, la formación de ascosporas tiene lugar tras la conjugación de dos células, aunque algunas pueden producir ascosporas sin que exista conjugación previa, teniendo lugar después la conjugación de las ascosporas. Tanto el número y el aspecto de esporas por asca, son típicos de cada especie de levadura, y se pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su pared y por su forma (redondeada, ovalada, arriñonada, falciforme, forma de saturno o de sombrero, hemisférica, angular). Las células de algunas levaduras se transforman en clamidosporas mediante la formación de una gruesa pared alrededor de la célula, tal como ocurre, por ejemplo, en las especies de los géneros Candida, Rhodotorula y Cryptococcus

Características de cultivo
En la mayoría de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su identificación. En los cultivos con agar, es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la observación microscópica es la única forma segura que existe para poderlas diferenciar. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayoría de las colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias cambian poco de aspecto cuando envejecen, otras se secan y se vuelven rugosas. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del líquido y producen
Propiedades fisiológicas
Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse. El intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general, parecido al de los hongos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30ºC y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47ºC. Una reacción ácida del medio, próxima a un pH de 4 a 4.5, estimula el crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios básicos, no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos, crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la producción de los sabores o “bouquet” de los vinos.

Clasificación e identificación
La clasificación de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de nuevas técnicas basadas en Biología Molecular, ha permitido separar o reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de él a la división Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En esta división, las levaduras se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los Eumicetos (Tabla 1), la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello esporógenas, y la Deuteromycotina representadas por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas no esporógenas. Los géneros de las levaduras esporógenas englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3 subfamilias. Los géneros de las levaduras no esporógenas constituyen la familia Cryptococcaceae. Además las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones género y especie, en subespecies y variedades, que a menudo adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonómicas, o varias especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo que la clasificación se complica aún más y se incrementa el número de sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificación e identificación de las levaduras son los siguientes:
1.- Producción de ascosporas.
2.- Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones.
3.- Forma de reproducción asexual.
4.- Producción de micelio.
5.- Forma de película en medio liquido.
6.- Color de la colonia.
8.- Propiedades fisiológicas: producción de ácido, actividad ureásica.
9.- Caracterización bioquímica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993):
- Fermentación de glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y
rafinosa.
- Crecimiento en 18 sustratos carbonados:
Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa.
Hexosas: D-glucosa.
Disacáridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa.
Trisacáridos: rafinosa.
Polisacáridos: almidón.
Alcoholes: eritriol, ribitol, D-manitol, inositol.
Ácidos orgánicos: ácido succínico, ácido cítrico.
- Asimilación de nitratos.
- Crecimiento a 37ºC.
- Crecimiento en medio con vitaminas.
- Producción de almidón.

Selección de levaduras
El estudio de la dinámica, cuantificación y composición de la microbiota responsable de las fermentaciones espontáneas, ha mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona vitivinícola e incluso dentro de los depósitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de aislamiento, cambios en las condiciones climáticas, etc. Por tanto, la necesidad de asegurar la fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos, requiere cada vez más, el uso de cultivos iniciadores. Las levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de calidad más uniforme que los que se producían con las fermentaciones espontáneas. Este último punto es el que genera el debate acerca de la utilización o no de inóculos, ya que garantizan repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el producto. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son: específicas del área, totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos parcialmente, de las características únicas de los productos obtenidos.

Las características propias de la zona pueden ser por tanto, un aspecto interesante a la hora de seleccionar una levadura, aunque hay muchos otros que también se tienen que tomar en cuenta. La importancia de estos parámetros puede ser relativa, dependiendo del producto para el cual quieren ser utilizados, algunos de los criterios utilizados para seleccionar levaduras se pueden observar mas adelante. Por tanto, la selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentación correcta, así como para mejorar las características del producto final, ya que las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distinción al producto obtenido, tales como el glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc.

FERMENTACIÓN

Fermentación
Definición
Cambios químicos en las sustancias orgánicas producidos por la acción de las enzimas. Esta definición general incluye prácticamente todas las reacciones químicas de importancia fisiológica. Actualmente, los científicos suelen reservar dicha denominación para la acción de ciertas enzimas específicas, llamadas fermentos, producidas por organismos diminutos tales como el moho, las bacterias y la levadura. Por ejemplo, la lactasa, un fermento producido por una bacteria que se encuentra generalmente en la leche, hace que ésta se agrie, transformando la lactosa (azúcar de la leche) en ácido láctico. El tipo de fermentación más importante es la fermentación alcohólica, en donde la acción de la cimasa segregada por la levadura convierte los azúcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de carbono. Hay otros muchos tipos de fermentación que se producen de forma natural, como la formación de ácido butanoico cuando la mantequilla se vuelve rancia, y de ácido etanoico (acético) cuando el vino se convierte en vinagre.
Generalmente, la fermentación produce la descomposición de sustancias orgánicas complejas en otras simples, gracias a una acción catalizada. Por ejemplo, debido a la acción de la diastasa, la cimasa y la invertasa, el almidón se descompone (hidroliza) en azúcares complejos, luego en azúcares simples y finalmente en alcohol.
La glicerina, la propanona, el butanol y el ácido butírico se producen actualmente a escala comercial por procesos especiales de fermentación. Varios productos de fermentación de la leche como la lactobacilina, el kéfir y el yogur se consumen abundantemente debido a sus propiedades nutritivas.
La acción de ciertas bacterias sobre los carbohidratos no digeridos produce la fermentación en el intestino humano. Como resultado, pueden producirse ciertos gases como el sulfhídrico y el dióxido de carbono en cantidades suficientes como para causar distensión y dolor. También pueden producirse ciertos ácidos como el láctico y el etanoico en los intestinos de los bebés, provocando diarreas.
Principios del descubrimiento de la fermentación
Louis Pasteur (1822-1895), químico y biólogo francés que fundó la ciencia de la microbiología, demostró la teoría de los gérmenes como causantes de enfermedades (patógenos), inventó el proceso que lleva su nombre y desarrolló vacunas contra varias enfermedades, incluida la rabia.
Pasteur, hijo de un curtidor, nació en Dole el 27 de diciembre de 1822, y creció en la pequeña ciudad de Arbois. En 1847 obtuvo un doctorado en Física y Química por la Escuela Normal de París. Tras convertirse en ayudante de uno de sus profesores, inició investigaciones que le llevaron a un descubrimiento significativo: comprobó que un rayo de luz polarizada experimentaba una rotación bien a la izquierda o a la derecha cuando atravesaba una solución pura de nutrientes producidos naturalmente, mientras que si atravesaba una solución de nutrientes orgánicos producidos artificialmente no se producía rotación alguna
Llegó a la conclusión de que las moléculas orgánicas pueden existir en una o dos formas, llamadas isómeros (es decir, que tienen la misma estructura y difieren tan sólo en que son imágenes especulares la una de la otra), que llamó, respectivamente, formas levógiras y formas dextrógiras. Cuando los químicos sintetizan un compuesto orgánico, se producen ambas formas en igual proporción, cancelando sus respectivos efectos ópticos. Los sistemas orgánicos, por el contrario, tienen un elevado grado de especificidad y capacidad para discriminar entre ambas formas, metabolizando una de ellas y dejando la otra intacta y libre para rotar la luz. Pasteur es considerado, por estos estudios, el fundador de la estereoquímica (área de la química que estudia la estructura tridimensional de las moléculas).
Trabajos sobre fermentación
Tras pasar varios años investigando e impartiendo clases en Dijon y Estrasburgo, en 1854 se marchó a la Universidad de Lille, donde fue nombrado catedrático de Química y decano de la Facultad de Ciencias. Esta facultad se había creado, en parte, como medio para aplicar la ciencia a los problemas prácticos de las industrias de la región, en especial a la fabricación de bebidas alcohólicas. Pasteur se dedicó de inmediato a investigar el proceso de la fermentación. Aunque su convicción de que la levadura desempeñaba algún tipo de papel en este proceso, no era original, logró demostrar, gracias a sus anteriores trabajos sobre la especificidad química, que la producción de alcohol en la fermentación se debe, en efecto, a las levaduras y que la indeseable producción de sustancias (como el ácido láctico o el ácido acético) que agrian el vino se debe a la presencia de organismos como las bacterias. La acidificación del vino y la cerveza había constituido un grave problema económico en Francia; Pasteur contribuyó a resolver el problema demostrando que era posible eliminar las bacterias calentando las soluciones azucaradas iniciales hasta una temperatura elevada.
Pasteur hizo extensivos estos estudios a otros problemas, como la conservación de la leche, y propuso una solución similar: calentar la leche a temperatura y presión elevada antes de su embotellado. Este proceso recibe hoy el nombre de pasteurización.

12.11.2008

Saccharomyces cerevisiae en la fabricación del licor cocuy.
¿Qué es el licor de “cocuy”?
El licor "cocuy" es una bebida artesanal, producida por las comunidades rurales en el occidente de Venezuela mediante un proceso de fermentación y destilación del mosto extraído del Agave cocui. Este estudio fue enmarcado en el "Programa Agave" con el propósito de contribuir a rescatar esta actividad productiva tradicional. En vista de la falta de información en relación al proceso autóctono se hicieron estudios de las levaduras fermentadoras, la optimización de la producción de etanol y la utilización del residuo de la destilación (vinaza) como medio de cultivo. Los aislados con mayor capacidad fermentativa fueron seleccionados e identificados mediante parámetros morfológicos y metabólicos. Se compararon los niveles de consumo de azúcar de las levaduras con mayor capacidad fermentativa. Se estudió el efecto de la adición del azúcar blanca comercial y/o del fosfato de amonio y en la producción de alcohol en el proceso artesanal. Las concentraciones de azúcares en el mosto se evaluaron por refractometría, y el contenido de alcohol del licor por hidrometría. La utilización de la vinaza para la producción de biomasa como un componente del medio de cultivo fue comparada con un medio sintético mediante medidas del peso seco de la biomasa. Se confirma el papel de Saccharomyces cerevisiae en el proceso fermentativo espontáneo. Los resultados in situ evidenciaron un efecto favorable de la elevación del contenido de azúcar (11 a 18°Brix) y de la adición de fosfato de amonio dibásico (0,2 g/l). En estas condiciones, el tiempo de fermentación del mosto se acortó y la producción de licor aumentó hasta un 92%. Se demostró la posibilidad de utilizar la vinaza como un componente para un medio de cultivo de esta levadura, para iniciar la fermentación y para la producción de biomasa como una fuente de nutrientes de alto valor nutritivo para aves de corral o caprinos. Se recomienda apoyar los esfuerzos para desarrollar de esta importante fuente de ingresos para los campesinos que habitan las zonas semi-áridas de los estados Falcón y Lara.
HISTORIA DE SU OBTENCIÓN
Los indios Jiharas y Caquetíos, habitantes de Paraguaná, Coro y el Occidente falconiano, preparaban una bebida alcohólica con el zumo de la planta llamada "cocuy" (Agave cocui). Esta bebida, autóctona de los estados Lara y Falcón, es embotellada sin maduración, comercializada en Venezuela y exportada a Curaçao. En l976, la Ley de Alcoholes y Bebidas Espirituosas estableció normativas para la maduración del producto, siendo desde entonces una actividad clandestina, cada vez más precaria, en las zonas rurales semi-áridas del Occidente del país. Con el propósito de contribuir al rescate de esa actividad productiva, se implementó el "Programa Agave", incluyendo esta investigación en su primera fase (1998-2001) (1,2).
El mosto o "guarapo", obtenido a partir del prensado de los cormos de las plantas, una vez sometidas a hidrólisis por calor, es mantenido en barriles durante 3 a 5 días. El proceso de fermentación espontáneo depende de la cantidad de levaduras y de la concentración de azúcar del jugo. La destilación, introducida por los colonizadores españoles, se lleva cabo en un alambique rústico eficiente, obteniéndose una bebida con un 45 a 50% de etanol, muy similar a la bebida conocida como "tequila", originaria de México. En vista de la falta de información relacionada con el proceso artesanal autóctono, se abordó el estudio de las levaduras responsables de la fermentación, con la colaboración de los productores de Pecaya, en el estado Falcón.
Nuestros resultados permitieron confirmar el papel de Saccharomyces cerevisiae en la producción del licor cocuy, evaluar el aumento de la productividad mediante la adición de azúcar blanca de caña y fosfato de amonio dibásico, así como establecer la posibilidad de la utilización del residuo del destilado, llamado "vinaza", para el cultivo de esta levadura como iniciador de la fermentación y fuente de alimento.
MATERIALES Y METODOS
Toma de muestras: Seis alícuotas de 1 litro del mosto de Agave cocui fueron recogidas en 3 oportunidades durante el proceso artesanal de dos productores, directamente de las pipas, las cuales pueden contener de 200 a 250 litros (al inicio del proceso fermentativo y antes del destilado), en la localidad de Pecaya, situada en la zona semi-árida al sur del estado Falcón, en Venezuela, donde se fabrica tradicionalmente el licor cocuy, obtenido por destilación en alambiques caseros del mosto fermentado.
Aislamiento de las levaduras fermentadoras e identificación: Las muestras fueron sembradas por agotamiento por estría en placas de Petri, en medio Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) e incubadas a temperatura ambiente del laboratorio durante una semana. La identificación de las cepas seleccionadas se hizo mediante estudios morfológicos en microscopía de luz, tamaño, temperatura óptima de crecimiento, formación de ascosporas en medio Gorodkowa, coloración con verde malaquita y safranina y prueba de asimilación de azúcares (auxonograma) en medio Yeast Nitrogen Base DIFCO 0,067 g, agar 20 g/l (3, 4).
Pruebas de fermentación: Los aislados fueron cultivados en medio para la fermentación (caldo cerebro-corazón de Merck 25g, extracto de levaduras 5g, glucosa 10 g, azul de bromotimol 0,05 g en 1 litro, Ph 7) por el método de los tubos invertidos de Durham, incubados por 3 días a 30°C. Se seleccionaron los aislados que presentaron un 100% en la prueba de producción de CO2, y se aislaron por repiques en cuñas de SDA. Los cultivos se incubaron a 37°C por 7 días (3,5).
Ensayos de consumo de azúcar: Los aislados fueron crecidos en tubos con SDA durante 8 días. Tres asas de la colonia fueron repicados en 50 ml de medio líquido SD por 48 horas en agitación a 150 rpm, incubando a 35°C, para obtener la suspensión celular para la inoculación. Se realizaron las pruebas de la capacidad de fermentación y se comparó la eficiencia en el consumo de azúcares en las cepas seleccionadas (medio: solución de melaza a 17/18 °Brix, pH 5, en fiola de 1 l, incubando a 35°C por 7 días). El contenido de azúcares se evaluó en °Brix por refractometría, y se aplicó la interconversión de °Brix a porcentaje de azúcar peso/volumen (5,6).
Efecto de la adición de azúcar y fosfato diamónico en la producción de alcohol: Se comparó la productividad al inicio y al final del proceso artesanal en 4 condiciones experimentales: 2 con el fin de conocer el efecto de la adición de azúcar de caña blanca comercial por los productores (llevando la concentración del mosto puro de 11 a 18 °Brix), y 2 añadiendo 0,2g/l de fosfato diamónico. Se determinó % v/v de alcohol en el destilado por hidrometría con un alcoholímetro; se utilizó el análisis de kjeldahl para detección del nitrógeno en el destilado (6).
Producción de biomasa: Se comparó la producción de biomasa para la cepa S. cerevisiae UNEFM 16, medida por peso seco, entre un medio sintético y 2 medios complejos con melaza y/o vinaza. Medio sintético: D-dextrosa: 10 g/l; sulfato de amonio: 4g/l; sulfato de magnesio 2 g/l; extracto de levadura 6 g/l ; fosfato monopotásico 8 g/l. Medio con melaza: Sales de amonio 2 g/l; melaza 2 °Brix. Medio con vinaza y melaza: Vinaza 2 °Brix; melaza 2 °Brix; fosfato de amonio 4 g/l. Los cultivos se hicieron en 100 ml del medio sembrado post esterilización con 10 ml de una suspensión celular crecida en medio sintético en las mismas condiciones que los ensayos. Los cultivos fueron incubados por 2 días a 30°C a 100 rpm. en matraces de 250ml.
RESULTADOS
De los 188 aislados obtenidos de las diferentes muestras de mosto, un 95% presentaron capacidad para fermentar; 46 (24 %) presentaron la máxima eficiencia en las condiciones experimentales del laboratorio, siendo identificadas como S. cerevisiae 30 de ellas (
tabla 1; figuras 1 y 2).
El rango en el consumo de azúcar se estimó entre 41 y 78% para 16 cepas de S. cerevisiae, seleccionadas por su alto poder fermentativo (tabla 2).
Los resultados in situ permitieron confirmar un efecto favorable del azúcar y del fosfato de amonio en la productividad de proceso fermentativo artesanal, acortando el tiempo de fermentación y aumentando el volumen de licor obtenido de sólo l3 litros en el mosto puro hasta 25 litros. El tenor en alcohol se elevó a 49% con la adición de fosfato independientemente del contenido inicial de azúcar en el mosto. No se detectó la presencia de nitrógeno en el destilado. La temperatura en el mosto durante el proceso espontáneo se mantuvo a 29°C (tabla 3).
La biomasa alcanzada con un medio utilizando residuo de la industria azucarera (melaza) y de la destilación del mosto (vinaza) fue comparable al que se obtuvo con el medio sintético (
tabla 4).
DISCUSIÓN
El proceso de fermentación alcohólica en el proceso espontáneo artesanal dependería fundamentalmente de las levaduras Saccharomyces cerevisiae, especie responsable de la producción de bebidas alcohólicas como el tequila y el vino. Se trata de una población mixta, principalmente levaduras del género Saccharomyces con diferentes capacidades fermentativas y de asimilación de azúcares. No puede, sin embargo, descartarse el papel de otras especies de levadura en la población salvaje estudiada, ni que se pudiera establecer una sucesión durante el proceso. El campo por explorar es muy amplio, ya que se presupone que las levaduras juegan un papel importante en las características singulares que diferencian el producto según su origen, ya oficialmente reconocida la denominación para la producción licor cocuy en Pecaya.
La utilización de azúcar de caña refinada es una práctica establecida, habitual en la elaboración artesanal por los productores, con lo cual persiguen aumentar su producción, y, de hecho, se ha establecido la existencia de dos tipos de licor cocuy en Pecaya: tipo I (producido con mosto puro) y tipo II (mosto con azúcar blanca refinada) (2). Nuestros resultados demuestran que con este práctica se asegura un aumento de un 53% en el volumen de licor producido, si se compara con los l3 litros obtenidos con mosto puro.
Se ha señalado que las sales son necesarias para el desarrollo de las levaduras, y suelen encontrarse en pocas cantidades en los mostos, por lo cual se recomienda la adición de estos compuestos. El fosfato amónico es un material enológico oficialmente permitido por la Organization International du Vin, con un máximo permitido de 96 g por 100 litros (3,7,6). En nuestro estudio, la adición de 20 gramos por 100 litros de fosfato de amonio dibásico resultó en un acortamiento del tiempo de la fermentación tumultuosa, con intenso desprendimiento de gas carbónico. En los dos experimentos en los cuales esa sal fue añadida, se evidenció una concentración de un 49% de alcohol en el licor, independientemente de la concentración inicial de azúcar en el mosto. El volumen de destilado obtenido con el mosto con azúcar se incrementó un 92%.
Se pudo demostrar que se obtiene un substrato adecuado utilizando una mezcla de vinaza de caña de azúcar y la de ágave para el crecimiento de una cepa de S. cerevisiae, la cual presentó alto poder fermentativo y capacidad máxima para el consumo de azúcar. Se plantea la posibilidad la utilización de levaduras agregadas como "pie de cuba" como iniciador del proceso de transformación del azúcar en etanol en el proceso fermentativo, práctica utilizada en la producción vinícola (3).
Es importante considerar que en el momento en el cual se logre legalizar en Venezuela la producción de este licor, esta actividad podría suponer un problema, por la acumulación en el ambiente del residuo del proceso de destilación, la vinaza. Se ha comprobado que el pH bajo de la vinaza de ágave y la alta demanda de oxígeno de estos desechos no permitirían la disposición final en los suelos ni en los cuerpos de agua. Un proceso de separación de la biomasa, previo a la destilación de las levaduras crecidas en el mosto, permitiría disminuir el volumen del residuo. Este procedimiento se utiliza en la industria cervecera (3).
Se ha demostrado que la vinaza contiene algunos de los nutrientes necesarios para al desarrollo de las levaduras: hierro, sodio, potasio, calcio y otros elementos. La producción de biomasa con un medio de cultivo económico permitiría plantearse su cultivo. Estas levaduras representarían un componente importante para enriquecer la dieta de los animales domésticos criados por esas comunidades, como las aves y los caprinos.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Los resultados in situ evidenciaron la posibilidad de una optimización de la producción del licor mediante el uso del fosfato de amonio. Este compuesto mejora el desarrollo de las levaduras sin afectar la calidad del destilado. Se demostró la posibilidad de utilizar la vinaza como un componente para un medio de cultivo de esta levadura, para iniciar la fermentación y para la producción de biomasa, como una fuente de nutrientes de alto valor nutritivo para las aves de corral y los caprinos.
Nuestro estudio representa un primer esfuerzo para lograr una mejor comprensión de los factores microbiológicos que inciden en la calidad y la productividad del proceso de fermentación del licor cocuy, cuya composición es equivalente a la de algunos de los mejores los licores importados. Se recomienda favorecer el incremento en la producción artesanal, con el fin de contribuir a mejorar el nivel económico de las comunidades dedicadas a esa producción tradicional, y seguir las investigaciones que pudieran llevar a un desarrollo racional de esta fuente de ingreso, importante para los campesinos de los estados Falcón y Lara.
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