LEVADURAS...¿QUE SON?

¿QUÉ SON LAS LEVADURAS?
Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares, la mayoría se multiplican por gemación y algunas por escisión. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies. Históricamente, los estudios sobre microbiología enológica se han centrado en las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, que son las responsables de la fermentación alcohólica. Anteriormente se creía que sólo ellas participaban en el proceso de producción de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras no-Saccharomyces, especialmente durante la fase inicial de la fermentación, pueden influir en las propiedades organolépticas de las bebidas alcohólicas. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de éstas en la fermentación alcohólica, pero eran consideradas como compuestos químicos complejos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wöhler. Luis Pasteur, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en condiciones anaerobias; durante la cual el azúcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2
Las levaduras son los agentes de la fermentación y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hábitat encontrándose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribución se produce al azar. Existe un gran número de especies que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproducción y por la forma en la que transforman el azúcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios géneros, cada uno dividido en especies. Las especies más extendidas son Saccharomyces ellipsoideus, Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum, las cuales representan por sí solas el 90% de las levaduras utilizadas para la fermentación del vino. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo que se refiere a nutrición y al medio en que viven. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentación apropiada rica en azúcares, elementos minerales y sustancias nitrogenadas, tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentación sea tan rápido, pero así como se multiplican, pueden morir por la falta o el exceso de las variables mencionadas

Características generales
Las levaduras se clasifican en base a sus caracteres morfológicos, aunque para algunos microbiólogos, sus propiedades fisiológicas tienen mayor importancia. La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos, la mayoría se reproducen asexualmente por gemación, y otras especies lo hacen por fisión múltiple. Las levaduras que pueden reproducirse sexualmente se conocen como “verdaderas”, este proceso implica la formación de ascosporas, sirviendo la propia levadura como asca, de aquí que ellas se clasifican como Ascomicetos; por el contrario las “falsas” que no producen ascosporas, pertenecen a los hongos imperfectos.

Características morfológicas
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Además, los criterios morfológicos se basan en el modo de reproducción vegetativa de la morfología celular, de la formación de pseudomicelio y de micelio. La forma de la levadura puede ser desde esférica a ovoide, en forma de limón, piriforme, cilíndrica, triangular, e incluso alargada formando un verdadero micelio o un falso micelio. También se diferencian en cuanto a su tamaño, miden de 1-10 um ancho por 2-3 um de longitud. Son partes observables de su estructura, la pared celular, el citoplasma, las vacuolas, los glóbulos de grasa, y los gránulos, los cuales pueden ser metacromáticos, de albúmina o de almidón. Para poder observar el núcleo es preciso utilizar tinciones especiales. La estructura celular es de tipo eucariótico, pero sin sistema fotosintético. La pared rígida, se caracteriza por la presencia, en su composición, de dos polisacáridos: manano y glucano. Algunas levaduras producen una cápsula constituida por fosfomanos. El núcleo está rodeado de una membrana que persiste durante la división celular. El número de cromosomas es variable de unas a otras. Las levaduras en ningún caso son móviles.

Reproducción
La mayoría de las levaduras se reproducen por gemación multicelular o por gemación polar, que es el mecanismo en el cual una porción del protoplasma sobresale de la pared de la célula y forma una protuberancia, la cual aumenta de tamaño y se desprende como una nueva célula de levadura. En las levaduras que forman película, la yema crece a partir de una prolongación tubuliforme de la célula madre. El material nuclear replicado se reparte entre la célula madre y la célula hija (Frazier y Weathoff, 1998).
La reproducción sexual de las levaduras verdaderas (Ascomycotina) da lugar a la producción de ascosporas, desempeñando la función de asca, la propia célula de la levadura. En la mayoría de las especies de levaduras verdaderas, la formación de ascosporas tiene lugar tras la conjugación de dos células, aunque algunas pueden producir ascosporas sin que exista conjugación previa, teniendo lugar después la conjugación de las ascosporas. Tanto el número y el aspecto de esporas por asca, son típicos de cada especie de levadura, y se pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su pared y por su forma (redondeada, ovalada, arriñonada, falciforme, forma de saturno o de sombrero, hemisférica, angular). Las células de algunas levaduras se transforman en clamidosporas mediante la formación de una gruesa pared alrededor de la célula, tal como ocurre, por ejemplo, en las especies de los géneros Candida, Rhodotorula y Cryptococcus

Características de cultivo
En la mayoría de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su identificación. En los cultivos con agar, es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la observación microscópica es la única forma segura que existe para poderlas diferenciar. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayoría de las colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias cambian poco de aspecto cuando envejecen, otras se secan y se vuelven rugosas. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del líquido y producen
Propiedades fisiológicas
Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse. El intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general, parecido al de los hongos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30ºC y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47ºC. Una reacción ácida del medio, próxima a un pH de 4 a 4.5, estimula el crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios básicos, no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos, crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la producción de los sabores o “bouquet” de los vinos.

Clasificación e identificación
La clasificación de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de nuevas técnicas basadas en Biología Molecular, ha permitido separar o reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de él a la división Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En esta división, las levaduras se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los Eumicetos (Tabla 1), la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello esporógenas, y la Deuteromycotina representadas por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas no esporógenas. Los géneros de las levaduras esporógenas englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3 subfamilias. Los géneros de las levaduras no esporógenas constituyen la familia Cryptococcaceae. Además las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones género y especie, en subespecies y variedades, que a menudo adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonómicas, o varias especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo que la clasificación se complica aún más y se incrementa el número de sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificación e identificación de las levaduras son los siguientes:
1.- Producción de ascosporas.
2.- Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones.
3.- Forma de reproducción asexual.
4.- Producción de micelio.
5.- Forma de película en medio liquido.
6.- Color de la colonia.
8.- Propiedades fisiológicas: producción de ácido, actividad ureásica.
9.- Caracterización bioquímica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993):
- Fermentación de glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y
rafinosa.
- Crecimiento en 18 sustratos carbonados:
Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa.
Hexosas: D-glucosa.
Disacáridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa.
Trisacáridos: rafinosa.
Polisacáridos: almidón.
Alcoholes: eritriol, ribitol, D-manitol, inositol.
Ácidos orgánicos: ácido succínico, ácido cítrico.
- Asimilación de nitratos.
- Crecimiento a 37ºC.
- Crecimiento en medio con vitaminas.
- Producción de almidón.

Selección de levaduras
El estudio de la dinámica, cuantificación y composición de la microbiota responsable de las fermentaciones espontáneas, ha mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona vitivinícola e incluso dentro de los depósitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de aislamiento, cambios en las condiciones climáticas, etc. Por tanto, la necesidad de asegurar la fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos, requiere cada vez más, el uso de cultivos iniciadores. Las levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de calidad más uniforme que los que se producían con las fermentaciones espontáneas. Este último punto es el que genera el debate acerca de la utilización o no de inóculos, ya que garantizan repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el producto. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son: específicas del área, totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos parcialmente, de las características únicas de los productos obtenidos.

Las características propias de la zona pueden ser por tanto, un aspecto interesante a la hora de seleccionar una levadura, aunque hay muchos otros que también se tienen que tomar en cuenta. La importancia de estos parámetros puede ser relativa, dependiendo del producto para el cual quieren ser utilizados, algunos de los criterios utilizados para seleccionar levaduras se pueden observar mas adelante. Por tanto, la selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentación correcta, así como para mejorar las características del producto final, ya que las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distinción al producto obtenido, tales como el glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc.